N-乙酰半胱氨酸对大鼠慢性支气管炎与肺气肿形成影响的实验研究(2)
1.2 方法
1.2.1 制备实验动物模型 参照钟小宁及李红梅的方法建立动物模型[4，5]，SPF级健康雄性体质量(230±20)g Wistar大鼠24只(鼠龄3个月)，进行完全随机设计随机分为四组，第一组作为假吸烟组(A组)，第二组为慢性支气管炎并肺气肿组(B组)，第三组为NAC预防组(C组)，第四组为NAC治疗组(D组)。4组大鼠均用相同的饲料及水喂养(由广西医科大学动物实验中心提供)。A组(假吸烟组):n=6,将Wistar大鼠在第1、14天经Wistar大鼠气道内注入0.9%生理盐水(NS)0.2 ml,在气道内注入0.9%生理盐水前1 d用0.9%生理盐水给大鼠灌胃(1 ml/只),第2~13天及第15~28天放入自制0.22 m3玻璃箱内，每天2 h，且每天在放入箱前用0.9%生理盐水给大鼠灌胃(1 ml/只)；玻璃箱有一小孔与外界相通，保证常压状态，箱内放置无水氯化钙及钠石灰吸收水分和二氧化碳，测氧仪监测氧浓度使氧浓度稳定在21%；大鼠可自由进食、饮水。B组(慢性支气管炎并肺气肿组):n=6,第1、14天经Wistar大鼠气道内注入LPS溶液0.2 ml,在气道内注入LPS溶液前1 d用0.9%生理盐水给大鼠灌胃(1 ml/只),第2~13天及第15~28天每天在与A组条件相同的玻璃箱内烟熏2 h(每次5支，30 min/次)；且每天在烟熏前用0.9%生理盐水1 ml给大鼠灌胃(1 ml/只)。C组(NAC预防组):n=6,在气道内注入LPS溶液前1 d用NAC给大鼠灌胃，每只50 mg[9](用双蒸馏水稀释成1 ml溶液)，第2~13天及第15~28天每天在烟熏前NAC给大鼠灌胃(每只50 mg)；气道内注入LPS溶液及烟熏方法与B组相同。D组(NAC治疗组):n=6,在气道内注入LPS溶液前1 d用0.9%生理盐水给大鼠灌胃(1 ml/只),第2~13天每天在烟熏前用0.9%生理盐水给大鼠灌胃(1 ml/只)，在第15~28天每天在烟熏前NAC给大鼠灌胃(每只50 mg)，气道内注入LPS溶液及烟熏方法与B组相同。
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1.2.2 肺组织的病理组织学标本制备 右肺下叶以10%中性甲醛固定24 h,右下叶距肺门约3 mm处取材,连续切片行HE染色。
1.2.3 病理组织学评价指标及方法
1.2.3.1 气道炎症病变的观察指标及评分方法 根据Cosio等[6]设计的小气道病变评估方法和标准加以改进观察，每只大鼠任选5条直径在700~1 200 μm(管腔最短径/最长径≥0.7)的膜性细支气管，按表1观察小气道改变，取其平均值。气道炎症病变的观察指标及评分方法:观察小气道炎症包括以下各项指标:纤毛倒伏粘连缺失、上皮细胞糜烂脱落、杯状细胞增生、管壁中性粒细胞浸润、管壁淋巴细胞浸润及淋巴滤泡形成、管壁单核巨噬细胞浸润、管壁黏膜充血水肿。对各组大鼠按上述各项指标分别评分，无病变者为0级，将轻度、中度、重度异常分别评为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级。
1.2.3.2 肺气肿评分 用Rubio等[7]介绍的方法测定平均内衬间隔(MLI)和平均肺泡面积(AIA):每只大鼠至少取3个切片,在200倍镜下,苏木精-伊红(HE)切片沿最大横径和纵径任取10个视野(避开大血管和支气管),在每个视野正中心划十字交叉线,计算与交叉线相交的肺泡间隔数(NS)和每个视场面积(Sa，275 941.9 μm2)内肺泡数目(Na),同时测出十字线总长(L)。根据MLI=L/Ns、AIA=Sa/Na,计算MLI、AIA,以反映肺泡密度及平均肺泡面积。
, 百拇医药
1.3 统计学分析 使用SPSS11.5统计软件进行数据分析，计量资料的各组数据以均值±标准差(x±s)描述，对正态分布的计量资料进行参数检验。对计数资料进行非参数检验(具体方法在结果中说明)，P0.05),见表2。
2.2 肺组织病理学改变
2.2.1 小气道病理学改变分析 按照表1的各项观测指标对各个实验组的小气道进行病理形态分析，具体结果见表3。根据资料选用非参数检验(秩和检验)，从表3及检验结果显示出，与A组比较B组的小气道均存在纤毛损伤、上皮细胞变性坏死糜烂脱落、黏液杯状细胞增生、气道管壁黏膜充血水肿、管壁炎性细胞浸润(淋巴细胞、中性粒细胞、单核细胞)(P0.05)。(见图1-4)。
2.2.2 肺气肿分析 通过光学显微镜观察各个大鼠的HE染色肺组织切片，可见B组肺气肿明显，而C组及D组肺气肿不明显(见图4-6)。通过200倍光学纤维镜下观察及计算所得结果(见表4，采用单因素方差分析及LSD多重比较)，B组平均肺泡面积及平均内衬间隔比A组增大(P0.05)，说明C组无明显肺气肿形成,D组平均肺泡面积及平均内衬间隔比A组增大(P
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3 讨论
本实验显示以吸烟及脂多糖诱导的B组大鼠小气道出现纤毛损伤、上皮细胞变性坏死糜烂脱落、黏液杯状细胞增生、气道管壁黏膜充血水肿、气道平滑肌细胞断裂/增生及炎性细胞浸润管壁并平均肺泡面积增大，符合慢性支气管炎并肺气肿的病理改变，说明用B组方法制备的慢性支气管炎并肺气肿模型成立。
在本实验中，给予NAC抗氧化预防干预的C组中的中性粒细胞、巨噬细胞及淋巴细胞浸润均被抑制，无明显肺气肿形成；在D组中仅中性粒细胞被抑制，而巨噬细胞及淋巴细胞浸润均未能明显抑制，肺气肿仅是减轻，但仍存在一定程度的肺气肿,NAC可防治大鼠肺气肿，这与Rubio等[8]报道是一致的。此外，与钟小宁等[9]研究用红霉素抑制中性粒细胞仅是减轻肺气肿也是相符合的；表明慢性支气管炎并肺气肿的形成与大鼠抗氧化能力降低有关，且NAC是通过抑制炎性反应而防治肺气肿。氧化与抗氧化作用失衡在COPD发病中起重要作用，来自烟雾及慢性炎症过程中的活性氧(ROS)可通过活化有丝分裂活化蛋白激酶(MAPK)、核转录因子-КB(NF-КB)及蛋白-1(AP-1)启动和/或促进慢性炎症过程，激活中性粒细胞释放中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)及激活巨噬细胞释放金属蛋白酶(MMPs)进而破坏肺实质，此外活化T淋巴细胞诱导肺泡上皮细胞凋亡[1,2]。徐凌等报道[2]烟雾暴露2.5个月建立大鼠COPD模型后予N-乙酰半胱氨酸(NAC)治疗对大鼠炎症及肺气肿无改变，这可能与氧化应激长时间作用使分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(SLPI)失活及损伤组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)，从而致使SLPI抗NE等丝氨酸蛋白酶及抗炎的作用受到损害，HDAC抑制NF-КB等炎症因子转录的作用也被减弱[1,8，10]。本实验及Rubio等[8]实验均在给予促使大鼠肺气肿形成因素前予NAC干预能防治肺气肿形成可能正是NAC拮抗氧化应激对SLPI及HDAC损害并抑制氧化对炎症的扩大和对肺泡上皮细胞保护作用有关，这些有待进一步的研究。, 百拇医药(刘积锋 钟小宁 何志义 张建全 陈 罡 郑小珍)
1.2.1 制备实验动物模型 参照钟小宁及李红梅的方法建立动物模型[4，5]，SPF级健康雄性体质量(230±20)g Wistar大鼠24只(鼠龄3个月)，进行完全随机设计随机分为四组，第一组作为假吸烟组(A组)，第二组为慢性支气管炎并肺气肿组(B组)，第三组为NAC预防组(C组)，第四组为NAC治疗组(D组)。4组大鼠均用相同的饲料及水喂养(由广西医科大学动物实验中心提供)。A组(假吸烟组):n=6,将Wistar大鼠在第1、14天经Wistar大鼠气道内注入0.9%生理盐水(NS)0.2 ml,在气道内注入0.9%生理盐水前1 d用0.9%生理盐水给大鼠灌胃(1 ml/只),第2~13天及第15~28天放入自制0.22 m3玻璃箱内，每天2 h，且每天在放入箱前用0.9%生理盐水给大鼠灌胃(1 ml/只)；玻璃箱有一小孔与外界相通，保证常压状态，箱内放置无水氯化钙及钠石灰吸收水分和二氧化碳，测氧仪监测氧浓度使氧浓度稳定在21%；大鼠可自由进食、饮水。B组(慢性支气管炎并肺气肿组):n=6,第1、14天经Wistar大鼠气道内注入LPS溶液0.2 ml,在气道内注入LPS溶液前1 d用0.9%生理盐水给大鼠灌胃(1 ml/只),第2~13天及第15~28天每天在与A组条件相同的玻璃箱内烟熏2 h(每次5支，30 min/次)；且每天在烟熏前用0.9%生理盐水1 ml给大鼠灌胃(1 ml/只)。C组(NAC预防组):n=6,在气道内注入LPS溶液前1 d用NAC给大鼠灌胃，每只50 mg[9](用双蒸馏水稀释成1 ml溶液)，第2~13天及第15~28天每天在烟熏前NAC给大鼠灌胃(每只50 mg)；气道内注入LPS溶液及烟熏方法与B组相同。D组(NAC治疗组):n=6,在气道内注入LPS溶液前1 d用0.9%生理盐水给大鼠灌胃(1 ml/只),第2~13天每天在烟熏前用0.9%生理盐水给大鼠灌胃(1 ml/只)，在第15~28天每天在烟熏前NAC给大鼠灌胃(每只50 mg)，气道内注入LPS溶液及烟熏方法与B组相同。
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1.2.2 肺组织的病理组织学标本制备 右肺下叶以10%中性甲醛固定24 h,右下叶距肺门约3 mm处取材,连续切片行HE染色。
1.2.3 病理组织学评价指标及方法
1.2.3.1 气道炎症病变的观察指标及评分方法 根据Cosio等[6]设计的小气道病变评估方法和标准加以改进观察，每只大鼠任选5条直径在700~1 200 μm(管腔最短径/最长径≥0.7)的膜性细支气管，按表1观察小气道改变，取其平均值。气道炎症病变的观察指标及评分方法:观察小气道炎症包括以下各项指标:纤毛倒伏粘连缺失、上皮细胞糜烂脱落、杯状细胞增生、管壁中性粒细胞浸润、管壁淋巴细胞浸润及淋巴滤泡形成、管壁单核巨噬细胞浸润、管壁黏膜充血水肿。对各组大鼠按上述各项指标分别评分，无病变者为0级，将轻度、中度、重度异常分别评为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级。
1.2.3.2 肺气肿评分 用Rubio等[7]介绍的方法测定平均内衬间隔(MLI)和平均肺泡面积(AIA):每只大鼠至少取3个切片,在200倍镜下,苏木精-伊红(HE)切片沿最大横径和纵径任取10个视野(避开大血管和支气管),在每个视野正中心划十字交叉线,计算与交叉线相交的肺泡间隔数(NS)和每个视场面积(Sa，275 941.9 μm2)内肺泡数目(Na),同时测出十字线总长(L)。根据MLI=L/Ns、AIA=Sa/Na,计算MLI、AIA,以反映肺泡密度及平均肺泡面积。
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1.3 统计学分析 使用SPSS11.5统计软件进行数据分析，计量资料的各组数据以均值±标准差(x±s)描述，对正态分布的计量资料进行参数检验。对计数资料进行非参数检验(具体方法在结果中说明)，P0.05),见表2。
2.2 肺组织病理学改变
2.2.1 小气道病理学改变分析 按照表1的各项观测指标对各个实验组的小气道进行病理形态分析，具体结果见表3。根据资料选用非参数检验(秩和检验)，从表3及检验结果显示出，与A组比较B组的小气道均存在纤毛损伤、上皮细胞变性坏死糜烂脱落、黏液杯状细胞增生、气道管壁黏膜充血水肿、管壁炎性细胞浸润(淋巴细胞、中性粒细胞、单核细胞)(P0.05)。(见图1-4)。
2.2.2 肺气肿分析 通过光学显微镜观察各个大鼠的HE染色肺组织切片，可见B组肺气肿明显，而C组及D组肺气肿不明显(见图4-6)。通过200倍光学纤维镜下观察及计算所得结果(见表4，采用单因素方差分析及LSD多重比较)，B组平均肺泡面积及平均内衬间隔比A组增大(P0.05)，说明C组无明显肺气肿形成,D组平均肺泡面积及平均内衬间隔比A组增大(P
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3 讨论
本实验显示以吸烟及脂多糖诱导的B组大鼠小气道出现纤毛损伤、上皮细胞变性坏死糜烂脱落、黏液杯状细胞增生、气道管壁黏膜充血水肿、气道平滑肌细胞断裂/增生及炎性细胞浸润管壁并平均肺泡面积增大，符合慢性支气管炎并肺气肿的病理改变，说明用B组方法制备的慢性支气管炎并肺气肿模型成立。
在本实验中，给予NAC抗氧化预防干预的C组中的中性粒细胞、巨噬细胞及淋巴细胞浸润均被抑制，无明显肺气肿形成；在D组中仅中性粒细胞被抑制，而巨噬细胞及淋巴细胞浸润均未能明显抑制，肺气肿仅是减轻，但仍存在一定程度的肺气肿,NAC可防治大鼠肺气肿，这与Rubio等[8]报道是一致的。此外，与钟小宁等[9]研究用红霉素抑制中性粒细胞仅是减轻肺气肿也是相符合的；表明慢性支气管炎并肺气肿的形成与大鼠抗氧化能力降低有关，且NAC是通过抑制炎性反应而防治肺气肿。氧化与抗氧化作用失衡在COPD发病中起重要作用，来自烟雾及慢性炎症过程中的活性氧(ROS)可通过活化有丝分裂活化蛋白激酶(MAPK)、核转录因子-КB(NF-КB)及蛋白-1(AP-1)启动和/或促进慢性炎症过程，激活中性粒细胞释放中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)及激活巨噬细胞释放金属蛋白酶(MMPs)进而破坏肺实质，此外活化T淋巴细胞诱导肺泡上皮细胞凋亡[1,2]。徐凌等报道[2]烟雾暴露2.5个月建立大鼠COPD模型后予N-乙酰半胱氨酸(NAC)治疗对大鼠炎症及肺气肿无改变，这可能与氧化应激长时间作用使分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(SLPI)失活及损伤组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)，从而致使SLPI抗NE等丝氨酸蛋白酶及抗炎的作用受到损害，HDAC抑制NF-КB等炎症因子转录的作用也被减弱[1,8，10]。本实验及Rubio等[8]实验均在给予促使大鼠肺气肿形成因素前予NAC干预能防治肺气肿形成可能正是NAC拮抗氧化应激对SLPI及HDAC损害并抑制氧化对炎症的扩大和对肺泡上皮细胞保护作用有关，这些有待进一步的研究。, 百拇医药(刘积锋 钟小宁 何志义 张建全 陈 罡 郑小珍)